色谱柱技术始于1950年代。随着填料和填料技术的发展，色谱柱技术越来越成熟，其功能也越来越完善。已广泛应用于生命科学、环保、材料、食品、药物开发等领域。
液相色谱柱在色谱分析系统中主要起分离被检物质的作用，作为色谱系统的心脏，也是一种消耗品。为了减少损失，色谱柱的维护非常重要！
液相色谱柱使用中常见的问题包括柱子连接、柱子活化、柱子使用、柱子维护、柱子存放等。
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立柱连接
立柱安装方向
色谱柱安装应按同一方向连接，需按照色谱柱上的方向指示连接，尽量避免色谱柱接反！
常见的色谱柱连接有两个主要问题。色谱柱安装时，延长管接头长度过长，使螺纹变浅，导致密封不良和泄漏，进一步造成基线漂移或响应降低；反之，管道前段会出现死体积，导致峰形变宽，灵敏度降低。
理想的接头连接应具有以下特点：管道与界面之间无死体积；始终避免在超高压和高温下泄漏；优异的长期稳定性，防止管道滑动；使用方便。
管道的选择也很重要。分析液相系统常用的规格是内径为0.12和0.17mm的管道。更换管道时，首先确认当前管道规格，更换内径和长度相同的管道，否则更换前后的结果会不一致，因为管道的体积会影响柱外体积系统，从而影响峰形和保留时间。
02
反相柱活化平衡
1)首先，用甲醇或乙腈洗涤大约20个柱体积。
2)如果流动相含有缓冲盐，使用与流动相中初始比例相同比例的超纯水和有机相冲洗过渡液约20次柱体积，然后平衡并用含有缓冲盐的流动相冲洗大约柱体积的20倍或更多。
3）如果流动相不含缓冲盐，可以直接用流动相平衡柱子，大约柱体积的20倍或更多。
4)当基线和压力稳定后，根据连续注射结果的再现测试确定平衡是否完全平衡。如果不够，可以延长流动相的平衡时间。
03
反相柱冲洗并保存
1)用50:50甲醇或乙腈与水的混合溶液冲洗20-30倍柱体积；
2）用纯甲醇或乙腈冲洗20-30倍柱体积；
3)存放前将柱端接头上的塞子密封严密，以防止填料变干。
04
反相柱清洗和再生
清洗或反冲反相色谱柱时，用至少30倍柱体积的下列溶剂冲洗色谱柱：
将色谱柱与检测器断开，留出色谱柱末端的管线，放入接液的烧杯中，用不含缓冲盐的流动相（水/有机相）冲洗，然后用100%有机相（甲醇和乙腈）检查压力是否恢复正常。如果没有，请继续下一步。
如果压力没有恢复正常，丢弃色谱柱或考虑使用更强的条件进行清洁：75%乙腈/25%异丙醇、100%异丙醇、100%二氯甲烷、100%己烷。
值得注意的是，无论使用正己烷还是二氯甲烷，使用前或恢复使用反相流动相前都必须用异丙醇冲洗。
关于色谱柱反吹
尽管色谱柱不应轻易反吹，但当明确知道超压是由颗粒堵塞筛板或柱头污染补救措施引起时，反吹是有效的。反吹色谱柱可以快速冲洗掉颗粒物。此外，它可以快速冲出柱顶以强力吸附污染物。反吹后，色谱柱仍处于正向连接状态。但是，反吹也会带来负面影响。例如，它可能会导致柱床松动、保留时间的变化以及小粒径色谱柱的反吹可能会导致填充流动。等待。
其中，可反吹的色谱柱包括：粒径大于2um（2.7、3、3.5、4、5μm等）的色谱柱；不能反吹的色谱柱有：粒径小于2um的色谱柱（1.8μmRRHD/RRHT；1.9μmPoroshell）。
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色谱柱使用中的常见问题
液相色谱柱使用中常见的问题包括pH值、温度、溶剂耐受性、压力、样品等。色谱柱的使用条件不应超过制造商推荐的范围，包括压力、pH范围、水相耐受性、柱温等。当测试条件接近色谱柱使用范围的极限值时，色谱柱生活会受到影响。
01
如何调节C18柱的pH和温度来提高分离度？
答：通过调节pH和柱温来优化分离度是方法开发中非常重要的方法。简而言之，中性或不可电离的化合物对pH值的变化不敏感。对于可离子化的化合物，可以通过调节流动相的pH值和控制化合物的电离状态来改变化合物的反相保留。降低pH会增加酸性化合物的保留，而增加pH会增加碱性化合物的保留。调整pH值以改变化合物保留并优化组分之间的分离。
通常提高柱温会加速传质并降低保留，但不同化合物的保留对温度变化很敏感，因此也可以通过调整柱温和改变各组分的保留时间来优化分离。
02
塔总超压的原因是什么？
回答：过压通常是由包括色谱柱在内的液体流路堵塞引起的。需要进行分段排查，确定阻塞位置，然后根据阻塞位置排查阻塞的可能原因。
如果色谱柱堵塞，常见的原因有很多，如样品脏、基质复杂、前处理不好，或前处理后进入液相系统沉淀出来，造成堵塞或污染（解决方法：加强样品前处理）；由超压或使用超出色谱柱的pH范围引起填料碎裂，色谱柱被杂物颗粒堵塞（解决方法：根据试验条件选择合适的色谱柱，避免超量程使用）；仪器使用过程中零件磨损造成的堵塞（解决方法：及时更换损坏的零件）等，会造成系统柱压力升高。
03
C18柱晚峰时间有什么影响？高峰时间延迟一段时间后。是否与流动相有关？
答：液相色谱中影响化合物保留的主要因素包括：样品、色谱柱、流动相（流速、组成、比例等）、柱温等，如果在使用过程中发现保留时间漂移，则必须可以从以下几个因素进行调查：可以先检查相同条件下的压力曲线是否出现保留时间漂移前后的现象，以便初步调查可能的原因。如果压力曲线没有再次出现，首先确认试验条件是否发生变化，检查流动相的流速、组成、比例等是否发生了变化，是否有因泄漏引起的流速和比例的变化或气泡；对流动相组成变化敏感的样品和方法应保证每次制备的流动相的重现性；检查色谱柱是否堵塞或污染；仪器的温度控制是否准确等等，可能的原因有很多，具体的原因还需要进一步调查。
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我应该使用什么流动相来存放色谱柱？用纯有机试剂容易干燥吗？
答：反相柱可以存放在HPLC级甲醇或乙腈中，注意插紧塞子。一般情况下，只要把塞子堵好，溶剂就不容易干。当然，在存储溶剂中加入5%-10%的水是没有问题的。
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乙腈流动相总是容易聚合，有什么解决办法吗？
答：乙腈的聚合需要一定的条件和时间，所以一定要使用质量可靠的HPLC级溶剂，并保证所用溶剂尽可能新鲜。如果是长期存放的乙腈溶剂，使用前过滤会有所改善。
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小分子极性物质一般使用哪种液相色谱柱？
答：可以先尝试使用能容忍高比例水相的柱，增加流动相水比以增强保留。如果是可离子化的化合物，例如酸性或碱性化合物，可以先尝试通过在反相模式下调节流动相的pH值来增加保留。酸性化合物需要降低流动相的pH值，碱性化合物会增加流动相的pH值，具体取决于pH条件。选择可以承受的柱子。如果调整pH值后反相模式的保留仍然很弱，也可以考虑使用其他保留模式的色谱柱，如HILIC柱、HILIC-Z、HILIC-OH5或纯硅胶HILIC柱等，或使用离子交换色谱柱或正相色谱等。
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柱分离效果差怎么办？
答：色谱柱分辨率下降的主要原因是色谱柱效率的降低和色谱柱选择性的变化。柱效降低的原因有很多。如果由于连接不当导致柱效损失，只需重新正确连接即可。如果色谱柱在使用过程中由于色谱柱污染导致柱效降低或由于选择性变化导致分辨率降低，可以尝试清洗和再生色谱柱。如果是色谱柱本身损坏造成的，分离变化通常是不可逆的。只能更换色谱柱，使用新色谱柱时尽量避免各种损坏色谱柱的操作。
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