转化是分子克隆中的一步关键过程,通过它可产生多个拷贝的重组DNA分子。能够吸收游离的细胞外遗传物质的能力是采用细菌感受态细胞进行转化的前提。目的在于获得重组质粒上目标序列的复制。
开始转化之前:
准备LB琼脂板并使其凝固。如果使用预先灌装板,请确保将板加热至37°C。
根据质粒DNA中存在的抗生素标记,在LB琼脂中加入适当的抗生素。
如果需要对重组体进行蓝/白筛选,则在LB琼脂中加入1 mM IPTG、300μg/mL S-Gal或40μg/mL X-Gal以及500μg/mL柠檬酸铁铵。
如果使用电转感受态细胞,请将电穿孔室置于冰上。
将水浴加热至37°C。
将无菌SOC培养基加热至室温(或在水浴中升温至20-25°C)。
标准转化实验方案
将所需数量的试管从-70°C冰箱转移到湿冰中。如果需要,额外取用一个试管用于对照DNA。
让细胞解冻5分钟。轻弹培养管多次以获得均匀的悬浮液。
对于对照:将1μL(10 ng)pUC19对照DNA加入一个试管中。轻弹试管以便混合,并置于冰上。
将1 ng至50 ng纯化的质粒DNA直接加入其余试管的细胞中。轻弹试管以便混合,并置于冰上。
将细胞在冰上孵育30分钟。
将细胞转移到37°C水浴中静置刚好45秒。
将细胞转移至冰上静置2分钟。
将SOC培养基添加到每个试管中。将细胞转移到无菌聚丙烯试管中,并松开盖子以便培养物通气。
将细胞在摇床培养箱(225-250 rpm)上于37℃孵育1小时。
移取10-100μL每种转化的细胞悬浮液到含有选择抗生素的LB琼脂板上,并用无菌涂布器涂抹。
将板在37℃孵育过夜。
根据需要选择一个(多个)菌落和培养物。
从每种培养物中分离质粒DNA。
培养优选的克隆。
使用限制酶消化质粒DNA,用凝胶电泳分离。
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