优化PCR条件
即使使用经过预先设计和可商购获得的实验方案，方案的优化和验证也是必不可少的。为了确保实验方案具有所需的敏感性，并对目标靶标具有特异性，优化是必需的。例如，稀有mRNA的病原体检测或表达性能分析需要高灵敏度；SNP检测需要高特异性，病毒定量需要高特异性和高灵敏度。要求具有高特异性的实验方案在没有优化和适当对照的情况下进行时，特别易受影响。与此类似，当要在多重反应中同时检测多个靶标时，必须优化实验条件以平等地检测所有靶标。
可通过调整许多因素实现理想的检测性能，从而实现更高的分子灵敏度、特异性和精确度。从经验丰富的商业供应商处购买的检测产品仍然需要在使用它们的实验室内进行验证。应在研究条件下验证与测定性能有关的声明，包括测试样品、特定试剂和选择的仪器。
已经设计好的并符合所有期望的设计标准（参见PCR / qPCR / dPCR实验设计）的实验方案可能在广泛的条件下表现良好。然而，所有实验方案都具有一组最佳条件，这些条件取决于仪器、所选试剂（缓冲液条件）、引物浓度和/或退火温度 (Ta)、镁浓度、甚至升降温速率。由于通常在选定的仪器上并在标准缓冲液条件下进行测定，因此大多数优化程序集中于使用引物浓度或退火温度(Ta)/解链温度(Tm)来修改引物结合动力学上。
无论靶标是DNA（qPCR）还是RNA（RT-qPCR），以下预备步骤都有助于确保成功量化：
验证引物设计
优化引物浓度
优化引物退火温度
优化探针浓度
优化反应组分和多重条件
使用标准曲线和解链曲线分析验证性能
当采用先前出版物中的引物或使用商购获得的方案时，引物设计的验证尤其重要。可以根据PCR / qPCR / dPCR实验设计中提供的实验设计指导来审查引物设计。至关重要的是要确保：
引物与目标靶序列同源。
反向互补引物是正确的。仔细检查反向互补碱基顺序
检测到适当的剪接变体。
除非实验需要，避免使用SNP。
寡核苷酸和扩增子不采用二级结构。
反应寡核苷酸相互杂交的可能性小。
引物二聚体
引物彼此杂交的能力，特别是在3'末端，可能导致PCR期间引物延伸和形成靶标非依赖性产物，称为引物二聚体。每当产生和扩增引物二聚体产物时，它们将反应组分从合成所需产物中转移出来，从而降低检测效率和灵敏度。因此，引物二聚体是使用基于探针和基于SYBR Green I染料的检测反应中存在的问题。对于基于染料的检测，例如SYBR Green I，引物二聚体还影响测定特异性，因为非特异性DNA结合染料将与引物结合，并与目标产物一起被检测出来。因此，应避免使用可能形成引物二聚体的引物。
引物二聚体形成可能性
为了确定引物二聚体形成的可能性，使用引物设计软件来分析双链体形成。 OligoArchitect（sigma.com/probedesignonline）提供了自身二聚体和交叉二聚体杂交强度的详细信息（图9.1）。由引物与其自身或与其配偶体杂交形成的任何3'-末端二聚体必须非常弱（ΔG ≥ -2.0 kcal，图9.1）。
如何减少引物二聚体形成？
应避免任何具有末端ΔG < -2.0 kcal、同时又具有可延伸的3'-末端（5'-重叠）的引物。最强的总二聚体应该是不稳定的（ΔG ≥ -6.0 kcal）。为了避免强的3'-末端二聚体，同时保持特异性，选择在最后5个碱基中具有2个G或C残基的引物，在最后3个碱基中具有1个G或C，在3'-末端具有A或T（图9.1）。
图 9.1.引物产生引物二聚体的可能性分析。用OligoArchitect设计软件分析引物序列以确定它们形成双链体的能力。图中显示了自身二聚体和交叉二聚体形成的可能性，以供选择最佳引物时参考。如果反应中的所有引物具有相似的解链温度（Tm差异 ≤ 2°C），并且不形成强3'-双链体（ΔG ≥ -2.0 kcal），则多重qPCR将给出最佳结果。
优化引物浓度和退火温度 (T
当使用引物浓度优化实验条件时，选择固定的Ta（通常为60℃），并且对每种引物独立设置最佳条件。这在设计多重运行的测定时非常重要，因为所有反应必须在相同的退火温度下运行，并且这是一种策略，这种策略还可以用于挽救性能差、又没有替代设计可用的实验方案。技术上更简单的方法是选择固定的引物浓度，然后优化Ta ，对这些引物组合选择最佳结果。当使用多种测定和进行dsDNA结合染料检测时，例如SYBR® Green I，这是首选方法。但是，这种方法确实需要一种能够利用不同Ta选择同时运行几个反应程序的仪器。
优化引物浓度
当使用基于探针的qPCR时，通常同时使用500 nM引物和250 nM探针的最终浓度获得令人满意的结果，尤其是在PCR靶标丰富且不需要最大灵敏度的情况下。当使用基于SYBR Green I染料的检测以最小化非特异性扩增时，以及在优化多重反应时，使用200 nM与400 nM之间浓度稍低的引物，通常更好。要验证标准条件是否适合使用，请进行标准曲线分析（参见测定的评估）。如果检测是线性、可再现的，并且在样品中预期的目标浓度范围内梯度处于-3.2至-3.5之间，则可能没有必要进一步优化引物和探针浓度。
实验方案没有很好地优化的一些迹象是：重复运行之间缺乏再现性，并且通常效率低且不敏感。检测的性能通常在一系列引物浓度下测试，例如50 - 800 nM，用每种浓度的每种引物（图9.2；关于完整的实验方案，参见附录A，实验方案：引物的优化）。
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